PCR扩增产物的电泳分析 凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种. 一琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便快速最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为6265℃溶解后在37℃下维持液体状态约数小时主要用于DNA片段的回收质粒与外源性DNA的快速连接等.(一)凝胶浓度:凝胶浓度的
琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测(定性)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好条带比较集中可用于科研及检测分析二甲苯青:水溶液呈兰色电泳时其迁移速率与双链线性DNA大致相当指示剂一般与蔗糖甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液作用:①增加样品密度使其比重增加以确保DNA均匀沉入加样孔内②在电泳中形成肉眼可见的指示带可预测核酸电泳的速度和位置③使样品呈色使加样操作更方便普通电泳仪高压电泳仪紫外仪上观察电泳带及其
一PCR产物电泳产物检测时间 一般为48h以内有些最好于当日电泳检测大于48h后带型不规则甚致消失 二假阴性不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备②引物的质量与特异性③酶的质量及 ④PCR循环条件寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究1模板:①模板中含有杂蛋白质②模板中含有Taq酶抑制剂③模板中蛋白质没有消 化除净特别是染色体中的组蛋白④在提取制备模板时丢失过多或吸入酚⑤模 板核
PCR(Polymerase Chain Reaction聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:(1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链(2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下以目的DNA为模板
PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳 实验原理 实验步骤引物Up primer:5-TAT CCC TGC TCC TCA TCG T-3 Down primer:5-CGG ACC TCC TCC TGT CGT TA-3 引物设计的原则引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败:表现为扩增出目的带之外的多条带(如形成引物二聚体带),不出带或出带很弱,等等。引物设计有3条
目的基因PCR扩增产物的克隆 [实验原理]产物回收在高离子盐存在的情况下,DNA片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上,再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液,将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除,最后用低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。2T载体与PCR产物的连接源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在D
目的基因PCR扩增产物的克隆 [实验原理]产物回收在高离子盐存在的情况下,DNA片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上,再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液,将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除,最后用低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。2T载体与PCR产物的连接源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在D
聚合酶链式反应(PCR)及酶切鉴定转化产物 一、实验目的二、实验原理三、实验试剂四、实验步骤五、注意事项讲授内容学习和掌握PCR的基本原理和实验技术学习和掌握限制性内切酶双酶切鉴定转化产物的基本原理和实验技术掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和实验技术一、实验目的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种通过体外酶促反应大量、快速、选择性地合成目的DNA片段的核
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性) 问题1:无扩增产物 现象:正对照有条带而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物含量低 对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件:退火温度太高延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物 4.
聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段一实验目的1.学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法2.理解PCR基因扩增在分子生物实验技术中的重要性3.了解引物设计的一般要求二实验原理多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction PCR ):原理类似于DNA的变性和复制过程即在高温(93-95℃)下待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板而后在低温(3765℃)情况下
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