1:裂解方式的比较及选择2:裂解液的组成及作用3:常见裂解液4:蛋白质提取一般实验步骤细菌细胞组织培养细胞酶裂解: 如溶菌酶用于细菌细胞纤维素酶和果胶酶用于植物细胞)细胞悬浮液固体组织 作用 辉骏生物: 免费服务热线:400-699-166350mM?Tris()1?SDS 1:称量一定量的组织样本去除干扰物质比如血液等2:加入液氮研磨直到研磨成粉按每2
10(WV gml)过硫酸铵(APs)的配制:(100 ml)1. 称取10g过硫酸铵2. 加入100 ml的去离子水将固体粉末彻底溶解3. 贮存于4℃注意:10过硫酸铵最好现配现用配好的溶液在4℃保存可使用2周左右过期会失去催化效果5×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制:(1 L)1. 称取Tris粉末 gGlycine(甘氨酸)94 gSDS g2. 加入约800 ml的去离子水搅拌溶
3. 当蛋白质的分子量在15000200000之间时电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系符合下列方程: 1gMr =K―bmR 式中:Mr为蛋白质的分子量K为常数b为斜率mR为相对迁移率在条件一定时b和K均为常数 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图可获得一条标准曲线未知蛋白质在相同条件下进行电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro建立1969年由Weber和Osborn进一步完善一原理????? 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂NN—亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)NNNN-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶并以此为支持物进行电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分
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1. 标准蛋白质(Mark)与待检测蛋白样品2. 样品溶解液3. 30丙烯酰胺(丙烯酰胺Acr甲叉双丙烯酰胺Bis)4.凝胶缓冲液:SDS 加 磷酸盐缓冲液至100ml5. 1TEMED(NNN–四甲基乙二胺)过硫酸铵(AP)7.电极缓冲液:SDSmolL 磷酸盐缓冲液8.1琼脂:琼脂1g用上述缓冲液溶解至100ml 4℃保存9.固定液:甲醇:冰乙酸:水为1:2:710.染色液:考马斯亮蓝R–25
SDS-PAGE试剂配方30凝胶贮液(150ml 4℃保存) Acr: Bis:将Acr完全溶解于120ml水中再加入Bis使其完全溶解加ddH2O定容至150ml用滤纸过滤溶液4℃保存分离胶Buffer ( Tris-HCl 250ml)Tris::1g将Tris溶于200ml水中在磁力搅拌器上不断搅动溶液使其完全溶解用HCl调节pH至此过程中加入HCl时浓度需逐渐降低越接近目标pH越要小心防
SDS-PAGE电泳的问题Q:SDS-PAGE电泳的基本原理A:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠) SDS能断裂分子内和分子间氢键破坏蛋白质的二级和三级结构强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子按比例结合形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物这种复合物由于结合大量的SDS使蛋白质丧失了原有的电荷状态
SDS-PAGE分离胶(即下层胶):SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6胶50-150kD8胶30-90kD10胶20-80kD12胶12-60kD15胶10-40kD成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)8胶51015203050蒸馏水2.34.66.99.313.923.230Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31M TrispH8
SDS-PAGE根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶):SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6胶50-150kD8胶30-90kD10胶20-80kD12胶12-60kD15胶10-40kD成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)6胶51015203050蒸馏水2.04.06.08.012.020.030Ac
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