双酶切概述 双酶切反应 (Double Digests) 1同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer以保证100的酶活性NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切由于内切
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双酶切buffer的选择:1U :Supplied with its own unique reaction buffer that is different from the four standard NEBuffers. Itspatibility with the four standard NEBuffers is indicated by the chart.2BSA :
前一阵子一直在做双酶切质粒重组失败了 很多次不过很快改善了 实验方法用2周重组了 14个质粒现就自己的体会谈一下质粒重组的一些个人经验1回收PCR产物:在进行PCR扩增时候给引物两端设计好酶切位点一般说来限制酶的 选择非常重要尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶如BamHIHindIII提前看好各的双切酶所用公用的BUFFER以及各酶在公用BUFFER里的效率选好酶切位点后在各个酶的两边
Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表■ 说明使用二种酶同时进行DNA切断反应 (Double Digestion) 时为了节省反应时间通常希望在同一反应体系内进行TaKaRa采用Universal Buffer表示系统并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性尽管如此在进行Double Digestion
实验三 DNA限制性内切酶 消化酶切实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上并切割双链DNA限制性内切酶酶分子识别位点切割位点 限制作用是否需用 ATPⅠ类 三亚基双功能酶 二分非对称至少在识别位点外 1000bpYesⅡ类内切酶与甲基化酶分子不在一起4-6bp 大多数为回文对称结构 在识
双酶切连接反应的经验1 在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近必须注意酶切顺序因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割有的酶要求识别序列两端有多个碱基的则必须先切否则就可能造成酶切失败2 回收PCR产物:回收的PCR产物片段=1:10 一般取前者后者取pmol为单位的DNA转换为为g单位的DNA:(X pmoles×长度bp×650) 1000000 (注:
Click The search for new specificities continues both biochemically by the analysis of cell-extracts andputationally by the analysis of sequenced genomes. Although most activities encountered toda
专业【双荧光素酶报告实验】目录目录实验原理实验步骤参考案例1目录目录实验原理实验步骤参考案例201实验原理12实验简介实验原理3实验结果图3· 介绍:是通过将预测能够与miRNA结合的靶基因3’UTR序列插入载体中萤火虫荧光蛋白(firefly luciferase)的3’UTR。· 优点: 蛋白不需要翻译后加工,所以一旦翻译后立即产生报告活性,检测快速;光产物具有最高的量子效率,因而非常灵敏。·
DNA的酶切实验采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接酶切可以是单酶切也可以是双酶切单酶切操作比较简单但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同(主要是盐离子浓度不同)或反应温度不同这时可以采用如下措施解决:1)先用一种酶切然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切2)先进行低盐要求的酶酶切然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求加入第二种酶进行酶切3)使用通用缓冲
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