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重组蛋白的大规模表达与纯化主要基于大肠杆菌(E. coli)表达系统1目标基因亚克隆利用KOD-PlusPfu等高保真酶通过PCR扩增含有酶切位点的目标基因连接到表达载体上(以PET系列载体为主)这些载体含有HisGST和Trx等助溶标签便于后续纯化同时这些载体上含有蛋白酶的酶切位点可按客户要求切除或保留标签2目标蛋白的表达与纯化将重组表达载体转化合适的大肠杆菌表达菌株中对时间温度以及IPTG浓度
中国兽医学报
第二部分:蛋白的纯化如何区分蛋白表达在上清还是包涵体破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中还有可能是二者中都有分布根据我们实验室的经验超声碎菌之后如果菌液比较清亮沉淀比较少那表达的蛋白基本上是可溶的但如果超声完之后 菌液是浑浊的而且当离心之后离下的沉淀比较多而且沉淀的颜色也比较白那基本上就是包涵体了包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成 的
1.? 原核体系2. 真核体系 植物可大面积种植可以廉价大规模生产转基因植物制作费时表达的组织特异性较难控制表达量较难提高分离纯化不方便一般由宿主细胞匹配的整合机制的载体整合载体在基因组上表达 各种用于抗体识别的标记 His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和可以通过添加 mM EDTA来去除重金属离子的干扰His-tag被包裹在不
复旦大学生物化学系黄伟达whuang@,2005年12月8日于华东理工大学 重组蛋白质的表达、复性与纯化为什么要重组基因表达? 1?蛋白质功能研究 2 生物制药和疫苗生产 3?疾病的基因治疗 4?食品、化工用酶制剂 5?抗虫、抗逆植物改良6 细胞代谢产物的富集基因表达体系及优劣势大肠杆菌表达体系蛋白质的复性工作中经常碰到的问题基因表达体系 1?原核体系2 真核体系 大肠杆菌 (Escherich
建议在中性或弱碱性(pH7-8)有氯化钠存在的条件下进行结合缓冲液和样品中含有盐能够消除离子交换效应但对蛋白主材的结合影响大磷酸缓冲液经常使用通常也可以使用Tris-HCl缓冲液但是当金属离子和蛋白的亲和力弱的时候应该避免使用因为它可能会降低结合强度避免在缓冲液中使用螯合试剂比如EDTA或柠檬酸咪唑经常用来洗脱组氨酸标签蛋白因为它可以通过和金属离子结合而高效地替换掉组氨酸应当使用低浓度的咪唑来洗掉
重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量按Qiagen的操作手册进行,具体步骤如下。一、重组蛋白质的诱导表达1挑取转化有质粒的单菌落,接种于3ml 选择性LB液体培养基中,37?oC,250 rpm/min振摇培养过夜。2次日将培养过夜的菌液500 μl再接种于10 ml(1:20)选择性LB液体培养基中,37?oC,250 rpm/min振摇培养至光密度(OD600=06)时,取1 ml样本作
DNA与RNA的比较比较项目DNARNA名?称脱氧核糖核酸核糖核酸组成元素CHONP?基本单位名称核 苷 酸脱氧核苷酸核糖核苷酸成分五碳糖脱氧核糖核糖磷酸磷?酸含氮碱基腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G)胞嘧啶(C)胸腺嘧啶(T)尿嘧啶(U)合成需用的酶DNA聚合酶DNA连接酶等RNA聚合酶等空间结构每个核酸分子是由几十个乃至上亿个核苷酸连接形成的长链规则的双螺旋结构通常呈单链结构种?类通常只有1种有mRNA
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