原位杂交探针制备步骤1 转录模板的选取:选取目的基因中150-1200bp 长短的无ployA尾巴的非保守区段为模板。如果模板长度大于500bp, 杂交前需要将探针进行温和碱水解,小于500bp 探针杂交前则可不进行碱解。2 转录模板的制备:因为转录模板的纯度直接影响着探针合成的质量和数量,所以一般用质粒纯化试剂盒提取质粒。首先,将模板DNA片断连接到 pGEM-T easy 克隆载体上, 转
原位分子杂交原位杂交核酸分子杂交技术与组织化学技术相结合的一项技术它以带标记物的核酸作为探针在一定条件下在组织细胞原位与待测核酸序列(如DNARNA)进行杂交形成杂交体然后通过与标记物相应的检测系统从而在原位对组织细胞中待测的核酸序列进行定性定位和相对定量的研究分子生物学技术中的杂交液相杂交: 参加反应的二条核酸都游离在溶液中固相杂交: 将一条核酸链固定(点样或吸印转移)到固体的支持物上 再
mRNA原位杂交(In Situ Hybridization, ISH)原理:碱基配对目的:揭示特异mRNA在组织和细胞中的分布步骤:制备标记的核酸探针(RNA、DNA) 制备组织切片 组织预处理(使探针易于进入组织) 探针与组织切片杂交 洗片 检测(可视化)一、制备标记的探针1 放射性标记(直接检测)2 非放射性标记荧光标记(直接检测)酶标记(直接检测)半抗原标记(生物素、地高辛) 抗体与半抗
溶解探针,配制杂交液。提前1天进行:杂交液A:772μl杂交液B:228μl杂交液B经80℃ 变性5 min 后迅速冰浴5 min,稍离心,与溶液A 混合,中枪头打匀,勿起气泡。-20℃保存。脱蜡与复水:二甲苯1 10分钟二甲苯210分钟二甲苯? + 100%乙醇?5分钟100%乙醇1 5分钟100%乙醇2 5分钟95%乙醇2分钟82%乙醇,085% NaCl2分钟70%乙醇/085%
原位杂交1 探针的设计与合成根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列用premier 设计引物p81和p82以卤虫cDNA为模板PCR扩增得到346bp的产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化引物编号引物序列长度p81TGCGGACGAAACAGGAAG18 bpp82GCTCAAACAGTGATGCCAGT20 bp目的片段克隆a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分载体与片段的摩尔比控制在1
线虫固定以下步骤除特殊说明外,均在 15ml 离心管中进行,离心转速取 7000rpm,时间为 1min,所用各试剂为 1ml。( 1) 将收集的新鲜孵化的线虫在 1× M9 Buffer 缓冲液中清洗三次;( 2) 在 3%的多聚甲醛固定液中 4℃ 固定 16 h 后,室温放置 4 至 5h;( 3) 用手术刀来回切割线虫,显微镜下观察直至 90%的虫体都被切断;( 4) 用 1
原位探针半定量点膜前需准备的试剂和溶液:1(点膜前新鲜配制,RNA用)RNA 稀释缓冲液:DEPC·H2O : 20×SSC : 甲醛 = 5 : 3 : 22 马来酸缓冲液:01M 马来酸,015M 氯化钠500ml 配方:马来酸58 gNaCI44 g固体NaOH35 gddH2O400 ml1 N NaOH 调PH至75,定容,灭菌,室温保存。310×TNM-50 PartⅠ:1M Tr
原位杂交流程卢朝晖 整理 以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针对石蜡切片进行mRNA检测的流程图这些实验操作方法很多参考书中均有但没有一本书是专为这个目的而系统地加以总结的因此特加以综合供同行参考在具体操作过程中很多地方可酌情变更 在临床应用中常常可以买到已经标记好的商品探针那么前面一大部分扩增基因酶切鉴定标记探针的工作就可以省去从石蜡切片处理做起即可
原位杂交试剂和溶液⑴ PBS(pH 74):140 mM NaCI, 27 mM KCI, 10 mM Na2HPO4 , 18 mM KH2PO4 ( Boehringer Mannheim in situ manual, Page 128 )10×PBS 1000ml配方: NaCI818 g KCI 20 g Na2HPO4?7H2O 2681 g KH2PO4 245 g800mldd
2152 植物组织原位杂交分析( 1) 植物材料的固定、包埋及切片、展片① 取新鲜番茄雄蕊,按不同发育时期投入标记好的装有 4%多聚甲醛固定液中( 4%多聚甲醛、 01% Tween、 01% Triton, PH 70;)。固定液:材料 ≥ 20: 1。② 多聚甲醛有剧毒,应在通风厨中抽真空。抽真空直至材料沉没在固定液中。尽量缩短时间且尽量不要使液体过分沸腾,以材料沉入固定液中为准
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