质粒DNA酶切连接转化筛选鉴定? (2011-04-29 10:42:22) javascript: ▼质粒DNA酶切连接转化筛选鉴定实验目的1学习和掌握限制性内切酶的特性2掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4学习和掌握热击法转化的原理和方法5掌握α互补筛选法的原理6学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法实
质粒DNA及λDNA的酶切连接转化及重组子的筛选鉴定陈倩倩 交流生 118627140313一实验目的:1学习和掌握限制性内切酶的特性2掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4学习和掌握热击法转化的原理和方法5掌握α互补筛选法的原理6学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法二实验原理:重组质粒的构建需要对DNA分子进行
前一阵子一直在做双酶切质粒重组失败了 很多次不过很快改善了 实验方法用2周重组了 14个质粒现就自己的体会谈一下质粒重组的一些个人经验1回收PCR产物:在进行PCR扩增时候给引物两端设计好酶切位点一般说来限制酶的 选择非常重要尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶如BamHIHindIII提前看好各的双切酶所用公用的BUFFER以及各酶在公用BUFFER里的效率选好酶切位点后在各个酶的两边
粘性末端是交错切割结果形成两条单链末端这种末端的核苷酸顺序是互补的可形成氢键所以称为粘性末端如EcoRI的识别顺序为: 5…… GAATT_C ……3 3…… C_TTAAG …… 5垂直线表示中心对称轴从两侧读核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG这就是回文顺序(palindrome)_和表示在双链上交错切割的位置切割后生成5……G和AATTC……33……CTTAA和G……5二个DNA片段各有
重组质粒的连接、转化及筛选概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(<10kb)且结构简单,质粒要比其它任何 载体都要好。在质粒 载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的
重组质粒的连接、转化及筛选概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(<10kb)且结构简单,质粒要比其它任何 载体都要好。在质粒 载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的
质粒DNA的提取与酶切电泳鉴定质粒提取关键:基因组DNA与质粒DNA的有效分离 (碱裂解法) 高pH使质粒DNA和染色体DNA变性同时沉淀蛋白质再将pH值调至中性质粒DNA较小很容易复性成双链而染色体DNA较大不会复性缠结成网状不溶物质从而可以通过离心除去注意事项:实验方法 碱裂解法 1挑取携带目标DH5α单菌落于3-5 ml LB(含Amp 100μgml)37℃ 振荡培养过夜(12
1. 实验目的 学习和掌握限制性内切酶的特性掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具 如Xba1和Nhe1: 5…TCTAGA…3 5…GCTAGC…3 3…AGATCT…5 3…CGATCG…5 5…T CTAGA…3 5…G CTAGC…3 3…AGATC T…5 3…CGATC G…
双酶切连接反应的经验1 在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近必须注意酶切顺序因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割有的酶要求识别序列两端有多个碱基的则必须先切否则就可能造成酶切失败2 回收PCR产物:回收的PCR产物片段=1:10 一般取前者后者取pmol为单位的DNA转换为为g单位的DNA:(X pmoles×长度bp×650) 1000000 (注:
- 210- 2007 年 5
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