中量质粒抽提原理: 质粒中量抽提的原理及各试剂组成均有质粒小量抽提一致其主要区别在于中量质粒抽提所获得的质粒含量更高同时中抽试剂盒具有去类毒素的作用其原因可能与吸附柱中含有类似氢氧化铝等对类毒素有吸附作用的物质有关 类毒素是指由于变性或化学修饰而失去毒性的毒素但仍保留其抗原性医学微生物学中将类毒素定义为:将细菌外毒素用甲醛处理脱去其毒性保存其免疫原性即为类毒素仪器与试剂: 3M N
质 粒 提 取一导论 ? 已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA 这些方法都含有以下3个步骤:1. l (一)细菌培养物的生长 细菌培养物的生长2. l (二)细菌的收获和裂解 细菌的收获和裂解3. l (三)质粒DNA的纯化 质粒DNA的纯化?(一)细菌培养物的生长? 从琼脂平板上挑取一个单菌落接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)然后从中
质粒抽提从甘油菌或平板接种至50ml LB培养基37℃ 250rpm培养5-8h(早上做)1转接至2L LB培养基37℃ 200rpm 过夜5000rpm 10min离心收集菌体称重按10mlg菌 加入裂解液I(可用纯化水代替)重悬菌体置于冰上按10mlg菌 加入裂解液II小心混匀冰上放置5-10min按8mlg菌 加入裂解液III轻柔混匀室温放置5min10000rpm 10min离心收
少量质粒快速抽提挑选转化板上的克隆于备份板上,尽量多涂几下,并转接于试管中沾取少量菌体于30ul溶菌酶溶液(或P1溶液)中加适量loading buffer充分混开后,加1/2体积(15ul)碱性SDS(或P2溶液),振荡5秒65℃水浴处理10min加入(1/3-1/5体积)月10ul水平衡酚:氯仿试剂振荡5秒12000rpm 2min上清直接上样跑电泳溶菌酶溶液4mg/ml溶菌酶在03M蔗糖
实验二 质粒DNA抽提一 实验原理质粒是细菌DNA染色体外的小型双链环状DNA复制子对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成质粒提取方法包括三个步骤:细菌的培养细菌的收集和裂解以及质粒DNA 的分离和纯化本实验采取的碱裂解法分离质粒的原理:在碱性环境中线性的大分子量细菌染色体DNA被变性而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然状态将pH调至中性并在高
1 质粒抽提溶液(I,II,III)Solution I?配制:100ml/瓶 葡萄糖:0991g(50mM/mol)Tris HCl (pH80)?: (1M Tris-HCl pH80)?? 5 mlEDTA: (05M?EDTA?pH80)?2 ml加ddH2O定容至:?????? 93 ml?????? 附:1M Tris-HCl (pH80)?? 配制: 50ml ?????????
中量提取质粒DNA准备以下灭菌的材料: ml EP 管烧瓶50 ml 离心管P1P2P3 溶液异丙醇5 M 盐酸胍1×TE(pH )E HYPERLINK lution盛有50 ml LB 培养液的容量为200 ml 的烧瓶从培养好的平板上挑取单克隆接种到盛有50 ml LB 培养液的烧瓶中置于37 ℃摇床(180 rpm)培养12-18 h将培养好的菌液到入灭菌的50 ml 离心管
USER GUIDE
碱裂解法质粒的提取材料溶液I:葡萄糖50 mMTris-Cl () 25 mMEDTA () 10 mM高压灭菌15 min4℃保存溶液Ⅱ: M NaOH (临用前10M NaOH母液稀释)1 SDS临用前配制溶液Ⅲ:5 M KAc 60 ml冰醋酸 ml水 ml定容至100 ml高压灭菌4℃保存酚氯仿异戊醇(25∶24∶1):按24∶1的体积比在氯仿中加入异戊醇按体积体积1:1混合饱和酚与氯仿异
质粒中提实验步骤(. TM EndoFree Plasmid Midi Kit)实验前准备1. 使用前将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer并于室温保存D6915-01: 加入80ml无水乙醇D6915-03: 每瓶加入200ml无水乙醇D6915-04: 每瓶中加入200ml无水乙醇离心操作方案1. 将带有质粒的
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