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单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版文本样式第二级第三级第四级第五级引 物 设 计引物引物的重要性引物设计的原则引物与PCR引物设计软件如何使用Primer Premier 5.0引物同源性分析引物(primers)引物是人工合成的两段寡核苷酸序列一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补→←3355Sense primerAnti
单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版文本样式第二级第三级第四级第五级PCR引物设计及相关软件使用PCR引物设计引物设计是PCR 技术中至关重要的一环使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败:表现为扩增出目的带之外的多条带(如形成引物二聚体带)不出带或出带很弱等等现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行可以直接提交模板序列到特定网页得到设计好的引物也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件引物设
PCR 引物设计Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性与适当引物杂交再用DNA聚合酶延伸扩增DNA的设想1983年Mullis发明了PCR技术使Khorana的设想得到实现1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首比喻1989年为PCR爆炸年Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖 5? 5?
3. Tm值Plasmid 1:GFPPrimer1: 5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………第二步:GC比值Tm值NR1序列:
BamHIBamHI(GGATCC)GFP序列变性 引物复性NR1序列:插入GFP后的组合序列
增加PCR特异性(一)1.引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点: 1)典型的引物18到24个核苷长引物需要足够长保证序列独特性并降低序列存在于非目的序列位点的可能性但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异
引物长度(primer length)产物长度(product length)序列Tm值 (melting temperature)ΔG值(internal stability)引物二聚体及发夹结构 (duplex formation and hairpin)错误引发位点(false priming site)引物及产物GC含量position) 反映了引物
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的在NCBI上搜索不同物种的同一基因通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment)各基因相同的序列就是该基因的保守区 2.引物长度一般在1530碱基之间 引物长度(primer length)常用的是18-27 bp但不应大于38因为过长会导致其延伸温度大于74℃不适于Taq DNA 聚
单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版文本样式第二级第三级第四级第五级引物设计实例分析引物设计基本原则引物长度(primer length)产物长度(product length)序列Tm值 (melting temperature)GC含量position) 引物二聚体及发夹结构 (duplex formation and hairpin)阅读框1. 引物的长度 一般为
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