单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版文本样式第二级第三级第四级第五级2010-7-26??目的基因的获取目的基因的获取PCR扩增pMD19-T载体连接TG1感受态制备重组载体1TG1感受态细胞转化转化细胞1抽取质粒进行电泳PCR检测阳性pET-28a载体酶切获取目的基因(阳性)转化细胞1重组重组载体2原核表达技术流程重组载体2BL21感受态转化转化细胞2抽取质粒进行电泳PCR检测阳性目的蛋白诱
原核表达 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达这种方法在蛋白纯化定位及功能分析等方面都有应用大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化磷酸化等翻译后加工常形成包涵体而影响表达蛋白的生
SlMPK20 融合蛋白的原核诱导表达与纯化① 将阳性 pET32a(+)SlMPK20 大肠杆菌菌种 Rosetta 划板活化;挑单菌落于含 100mg·L-1 氨苄( Amp)和 50 mg·L-1 氯霉素( CM)的液体 LB 中扩繁, 37 ℃, 200rpm,过夜;② 取 100 μl 扩繁的菌液于含相应抗生素的 30 mL 液体 LB 中摇约 25 h, 37 ℃, 200rp
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原核表达体系的构建刘华彬董浚键一实验材料(1)植物材料:拟南芥(2)载体及菌株:克隆及测序用载体为pMD18-T购自Takara宿主菌DH5α原核表达载体(pET30c )(3)PCR引物:登陆GeneBank查找目的基因序列以目的基因序列为模板设计引物(4)药品试剂:反转录试剂盒(TaKaRa)质粒小提试剂盒(TIANGEN)胶回收试剂盒Taq DNA聚合酶(TaKaRa)dNTPs(TaK
提取原核表达蛋白Protocol李卫红2016-7预实验:Rosseta菌,37℃试管摇菌,过夜;第二天将菌液全部加入到100mlLB中(载体抗性:氯霉素,kana),37℃摇菌(约1-2小时后)测OD值:06-08;取1ml做诱导前对照,四度保存(跑蛋白胶前直接取样加loading buffer);加入一定体积01M IPTG(终浓度为01mM);(也可设计一系列浓度梯度和处理时间,寻找最适浓
原核表达步骤目的片段连接上pET系列质粒后通过测序确定编码序列的准确性(T7通用引物)。 ://对编码序列进行稀有密码子分析。在线网页 对稀有密码子较多(一般大于15%)的载体建议使用Transetta(DE3)化学感受态细胞进行转化对稀有密码子较少的构建载体使用BL21(DE3)化学感受态细胞转化感受态细胞之后涂板(含抗生素的培养基,一般是卡纳或氯霉素),过夜培养后挑单克隆进
原核表达及检测摘 要:本实验采用IPTG诱导GFP在大肠杆菌中的表达表明随着时间的推移GFP的表达量越来越多随后用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况 关键词:原核表达 SDS-PAGE凝胶电泳 广义的原核表达是指发生在原核生物内的基因表达狭义的原核表达常出现于生物工程中是指通过基因克隆技术将外源目的基因通过构建表达载体并导入表达菌株的方法使其在特定原核生物或细胞内表达一个完整的表达系
有关原核表达及EMSA原核表达载体的选择。用于原核表达的载体很多,且含有各种各样的纯化标签,用的比较多的有6×His, GST, Myc, HA,S-Tag。实验室常用的带6×His的有pet28a,和pet30a,这两种载体基本上大同小异,这里以pet30a为例。酶切位点的选择。首先分析你需要表达的ORF,确定里面包含哪些酶切位点, 你可以表达你部分的蛋白或者全长,如果蛋白不大能够拿到全长C
分离胶:浓缩胶:SDS-试剂(1)30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(30%凝胶贮液):292g丙烯酰胺,08g甲叉双丙烯酞胺溶于终体积为100ml的去离子水中,置于棕色瓶中4℃保存(2)15mol/L Tris-Cl(pH88):1815gTris碱,溶于去离子水中,浓盐酸调pH至85,定容至100ml(3)l0mol/LTris-Cl(PH68):6gTris碱,溶于去离子水中,浓盐酸调pH至
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