预先配置20的DMSO4度预冷包括即将使用的冻存管2 收获PBMC细胞纯血清重悬PBMC细胞浓度最好是2×1073 逐滴加入等体积20的DMSO混匀4 将冻存管放于塑料泡沫盒中(装15ml离心管的那种)外面用保鲜袋扎紧放于-80度冰箱中过夜而后转移至液氮中冻存即可冻存的PBMC的复苏步骤与普通的细胞有所不同步骤如下1 取出冻存管37度水浴解冻2 用移液管将将冻存管中的细胞转移至15ml离心管中3
细胞的冻存细胞深低温保存的基本原理是:在-70℃以下时,细胞内的酶活性均己停止,即代谢处于完全停止状态,故可以长期保存。细胞低温保存的关键,在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内,水晶呈针状,极易招致细胞的严重损伤。 总的原则是缓慢冻存!!!一 材料:生长良好之培养细胞 ,新鲜培养基,DMSO ,无菌塑料冷冻保存管,血球计数盘与盖玻片 。二步骤:21 冷冻前一日前更换半量或全量培养基,
细胞的冻存细胞深低温保存的基本原理是:在-70℃以下时,细胞内的酶活性均己停止,即代谢处于完全停止状态,故可以长期保存。细胞低温保存的关键,在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内,水晶呈针状,极易招致细胞的严重损伤。 总的原则是缓慢冻存!!!一 材料:生长良好之培养细胞 ,新鲜培养基,DMSO ,无菌塑料冷冻保存管,血球计数盘与盖玻片 。二步骤:21 冷冻前一日前更换半量或全量培养基,
细胞冻存1. 实验前准备:细胞室及工作台紫外线照射15min培养液PBS胰酶小牛血清DMSO恒温水浴箱37℃预热备用收集对数生长期细胞在冻存前一天最好换液2.用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液PBS清洗2遍吸出冲洗液加入适量胰蛋白酶消化3. 适时去掉胰蛋白酶加入少量新培养液吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞使其成为均匀分散的细胞悬液4. 用吸管将培养液加入冻存管中离心(1000rmin10分钟)5. 去上
精子冷冻保存 (一)精子冷冻保存的意义 1.建立精子库用于男性无精症所致不育男性遗传性缺陷和携带者的生育治疗 2.肿瘤患者在接受放化疗前冷冻精子保存生育能力 3.取精困难者冷冻精子需要生育时或者行辅助生育时复苏后使用 4.经皮附睾精子抽吸术或睾丸活检获得的少量精子冷冻起来以备辅助生育技术过程使用 (二)冷冻保护剂的使用和作用机制 不加冷冻保护剂的精液
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细胞冻存和复苏实验基本原则:慢冻快融(最大限度的保存细胞活力)保护剂:甘油或二甲基亚砜作(能提高细胞膜对水的通透性)慢冻(可使细胞内的水分渗出细胞外减少细胞内冰晶的形成从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤)快复(保证细胞外结晶在很短的时间内即融化若缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤)?一细胞冻存?1. 冻存培养液?(10DMSO或甘油1020小牛血清)?
细胞冻存解冻方法与细胞计数一细胞冷冻保存1.材料:生长良好之培养细胞新鲜培养基DMSO(Sigma D-2650)无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)(wv)trypan blue(GibcoBRL15250-061)血球计数盘与盖玻片等速降温机(KRYO10SeriesII)2冷冻保存方法:(1)传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃
关于细胞复苏细胞冷冻保存与复苏原理 三木 转自 体外培养的原理和技术. 薛庆善 主编. 2001年2月.科学出版社 pp128-136 细胞冷冻保存与复苏原理在低于-700C的超低温条件下有机体细胞内部的生化反应极其缓慢甚至终止因此采取适当的方法将生物材料降至超低温即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时其内部的生化反应可恢复正常所谓冷冻保存就是将体外
细胞冻存冷冻保护剂:1. 渗透性保护剂:甘油二甲基亚砜丙二醇乙二醇原理:属低分子中性物质易与溶液中水分子结合易于穿透细胞2. 非渗透性保护剂:聚乙烯吡咯烷酮(PVP)蔗糖聚乙二醇葡聚糖白蛋白等原理:属大分子物质不能穿透细胞冰晶形成之前优先结合溶液中水分子降低细胞外溶液的电解质浓度减少阳离子进入细胞的数量 :
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